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| Dissertation / PhD Thesis/Book | PreJuSER-40523 |
2001
Forschungszentrum Jülich GmbH Zentralbibliothek, Verlag
Jülich
Please use a persistent id in citations: http://hdl.handle.net/2128/116
Report No.: Juel-3938
Abstract: Die $\textit{ex vivo}$ Vermehrung von humanen T-Lymphozyten gewinnt in der medizinischen Anwendung immer mehr an Bedeutung. Ein wichtiger Anwendungsbereich ist die adoptive Immuntherapie zur Bekämpfung viraler Infektionen und Tumoren bei Patienten, deren Immunsystem durch Krankheit oder Behandlung geschwächt ist. Neben der Produktion der für eine Therapie benötigten Zellmengen (bis 10$^{9}$ spezifische Zellen) ist die Erhaltung der Teilungsfähigkeit und der biologischen Aktivität von kultivierten und expandierten TLymphozyten nach Transfusion von zentraler Bedeutung. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Entwicklung eines Verfahrens für die Generierung spezifischer T-Lymphozyten. Als biologisches Modell wurde, ausgehend von mononukleären Zellen aus peripherem Blut, die Generierung von Zytomegalievirus spezifischen T-Lymphozyten angestrebt. Es erfolgte eine $\textit{in vitro}$ Charakterisierung von Immunzellen. Neben der ausführlichen Bestimmung von Oberflächenmolekülen mittels Durchflusszytometrie wurde die Effektorfunktion der Immunzellen untersucht. Dabei wurde ein Zytotoxizitätstest, gegen spezielle Zelllinien (K562, Raji und T2 Zelle), basierend auf der Freisetzung von Europium, etabliert und optimiert. Weiterhin wurde die Effektorfunktion dieser Zellen über IFN-$\gamma$ bestimmt. Hierzu wurde ein Test zur intrazellulären Detektion von IFN-$\gamma$ optimiert und ein IFN-$\gamma$ Sekretionstest eingesetzt. Beim Einsatz von stimulierenden Faktoren ($\alpha$CD3 mAb, $\alpha$CD28 mAb und IL-2) konnte eine polyklonale unspezifische Aktivierung und Proliferation von PBMCs erzielt werden. Nach der Untersuchung von verfahrenstechnischen Parametern (Zelldichte, Temperatur, Fütterungsstrategie, Osmolalität, pH-Wert, pO$_{2}$-Wert und IL-2 Verbrauch) konnte unter kontrollierten Prozessbedingungen in einem Suspensionsreaktor und anschließend in einem 20 L Rührkessel die Kultivierung im für Primärzellen großen Maßstab realisiert werden. Dabei wurde eine Gesamtzellzahl von 3$\cdot$10$^{10}$ Zellen mit einem Anteil von >90% T-Lymphozyten erreicht. Weiterhin zeigten vergleichende Untersuchungen von unspezifischen T-Lymphozyten in Gewebekulturflaschen und Suspensionsreaktor einen Erhalt von HCMV spezifischen T-Lymphozyten nach 14tägiger Kultivierung. Im Rahmen dieser Arbeit konnte ein Protokoll zur Generierung von Dendriten aus peripherem Blut etabliert werden. Hierzu wurden adhärente PBMCs nach Plastikadhäsion mit zytokinhaltigem Medium (GM-CSF, IL-4 und TNF-$\alpha$) für 9 Tage kultiviert. Die so erhaltenen Zellen exprimierten charakteristische Dendritenmarker und zeigten mit einem sternförmigen Zellkörper und Zellausläufern die dendritentypische Morphologie. In statischen Gewebekultursystemen wurden die Parameter für eine spezifische Stimulation über antigenpräsentierende Zellen zur Generierung HCMV spezifischer T-Lymphozyten optimiert. Als Antigen wurde im Rahmen dieser Arbeit das Matrix Struktur HCMV pp65$_{495-503}$ Peptid und das HCMV AD 169 Strain Protein aus Vorhaut Fibroblasten eingesetzt. Dabei wurde die Pulszeit der APCs mit Antigen, die Wahl der APCs, die Zelldichte, das Zellzahlverhältnis zwischen APC und T-Zellen, der Einsatz von serumhaltigem Medium, die IL-2 Zugabe, die Ausgangspopulation und die Restimulation untersucht. Mit diesen optimierten Stimulationsparametern wurde eine selektive Generierung von HCMV spezifischen T-Lymphozyten ermöglicht. Nach einer 1 bis 2wöchigen Vorkultur in statischen Kultursystemen konnte anschließend im Suspensionsreaktor eine Kultivierung unter kontrollierten Bedingungen realisiert werden. Nach wöchentlicher spezifischer Restimulation stieg der Anteil der IFN-$\gamma^{+}$-T-Lymphozyten wöchentlich um einen Faktor von 3. Mit einem Anteil von 23,4% am 28. Tag der Kultivierung konnten somit 7,5$\cdot$10$^{7}$ HCMV spezifische T-Lymphozyten im Reaktor generiert werden. Es wurden Rahmenbedingungen zur Generierung spezifischer T-Lymphozyten entwickelt, die eine Umsetzung in den klinisch relevanten Maßstab ermöglichen.
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